Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека




НазваниеУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
страница14/25
Дата публикации20.04.2013
Размер2.03 Mb.
ТипМетодические указания
vbibl.ru > Право > Методические указания
1   ...   10   11   12   13   14   15   16   17   ...   25


С целью предотвращения конденсации влаги извлеченные из морозильника флаконы с основными растворами антибиотиков, прежде чем открыть необходимо выдержать до достижения ими комнатной температуры.

Размороженные основные растворы должны быть использованы для приготовления рабочих растворов, их повторное замораживание не допускается.

Из основных растворов антибиотиков готовят рабочие двукратные концентрации. За основу берется конечная концентрация антибиотика в питательной среде, равная 1,0 мкг/мл (более высокие - 2, 4, 8 и т.д.; более низкие - 0,5; 0,25; 0,125 и т.д.). Реальные концентрации рабочих растворов должны учитывать фактор разбавления раствора антибиотика в питательной среде (обычно 1:10 в плотной среде и 1:2 в жидкой). Для приготовления рабочих растворов используется дистиллированная вода (метод серийных разведений в агаре) или жидкая питательная среда (метод серийных разведений в бульоне).

Примерный диапазон концентраций антибиотиков, используемых при оценке чувствительности к отдельным препаратам, приведен в табл. 8. В зависимости от целей исследования возможно использовать и иные диапазоны концентраций.
Таблица 8
^ ДИАПАЗОН КОНЦЕНТРАЦИЙ АНТИБИОТИКОВ

ДЛЯ ОЦЕНКИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ


Антибиотики

Концентрация, мкг/мл

Аминогликозиды

0,03 - 128

Ампициллин

0,25 - 128

Цефотаксим
Цефтриаксон


0,004 - 128

Цефтазидим

0,004 - 128

Хлорамфеникол

0,25 - 128

Ципрофлоксацин

0,004 - 8

Рифампин

2 - 32

Тетрациклин

0,25 - 128


6.7.1.1. Методы серийных разведений в агаре

Приготовление питательных сред с антибиотиками

Сухая агаризованная питательная среда растворяется и автоклавируется в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования колбы с питательной средой помещаются на водяную баню при 48 - 50 °С, где выдерживаются до достижения указанной температуры, после чего в них асептически вносят рабочие растворы антибиотиков (1 часть рабочего раствора антибиотика на 9 частей расплавленного агара). Затем среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри, толщина слоя питательной среды должна быть 3 - 4 мм.

Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах при 4 - 8 °С в течение 5 суток. При этом необходимо иметь в виду, что некоторые беталактамные антибиотики, особенно при низких концентрациях, не выдерживают даже указанный срок хранения.

Параллельно с чашками Петри, содержащими растворы антибиотиков, для контроля роста готовят чашки Петри без антибиотиков.

Приготовление суспензии исследуемого микроорганизма, ее стандартизация и инокуляция. Инкубация

Для приготовления суспензии используют 3 - 4-часовую бульонную или суточную агаровую культуру холерного вибриона.

Для получения бульонной культуры отбирают одну или несколько

четко изолированных колоний, легким прикосновением петли к центру

колонии переносят незначительное количество материала в пробирку с

4,0 - 5,0 мл жидкой неселективной среды, например МПБ. Инкубируют

при 37 °С. Приблизительно через 3 - 4 ч инкубации мутность

8

бульонной культуры соответствует 1 - 2 х 10 м.к./мл.

Для получения суточных агаровых культур можно использовать

только четко изолированные колонии, выросшие на неселективных

9

питательных средах. Взвесь агаровых культур в концентрации 10

м.к./мл готовят на стерильном изотоническом растворе или бульонной

среде по ОСО ГИСК им. Л.А. Тарасевича - ОСО-42-25-59-86П.

Конечная посевная доза на поверхности питательной среды должна

4

составлять 10 м.к. Поскольку коммерческие инокуляторы,

штампы-репликаторы или стандартная бактериологическая петля

диаметром 3,0 мм переносят 1 - 2 мкл жидкости, концентрация

7

вибрионов в суспензии для инокуляции должна быть 10 м.к./мл.

7

Для получения суспензии требуемой концентрации (10 м.к./мл)

бульонную культуру следует развести в 10 раз, а взвесь агаровой -

в 100 раз. Суспензию необходимо инокулировать на поверхность агара

в течение 15 мин. после приготовления, при этом образуется пятно

диаметром 5 - 8 мм.

После инокуляции чашки оставляют при комнатной температуре для подсыхания, далее переворачивают и инкубируют при 37 °С в течение 16 - 20 ч.

Для контроля качества приготовления суспензий периодически рекомендуется проводить подсчет реальных колониеобразующих единиц путем высева на плотную питательную среду.

Важнейшим требованием контроля качества постановки метода является высев использованной для инокуляции суспензии на плотную неселективную среду для контроля чистоты культуры.

Результат оценки антибиотикочувствительности имеет смысл учитывать только при подтверждении чистоты культуры.

Учет результатов проводят, поместив чашку на темную, не отражающую поверхность. За МПК принимают концентрацию, вызвавшую полную ингибицию видимого роста. Для дифференцировки нежного роста от налета, оставшегося после инокулята, в ряде случаев целесообразно использовать увеличение. Появление единственной колонии на чашке с концентрацией на 1 разведение выше, чем явная МПК, можно не учитывать.

При росте нескольких колоний или образовании "прозоны" исследование необходимо повторить, обратив особое внимание на чистоту культуры. В ряде случаев целесообразно получить субкультуру из единичных колоний, выросших на чашках с концентрацией антибиотика выше, чем явная МПК, и провести ее идентификацию.

Интерпретацию результатов проводят с учетом данных, приведенных в табл. 9, с отнесением штаммов к "чувствительным", "устойчивым" или "промежуточным".
6.7.1.2. Метод серийных разведений в бульоне

Наиболее распространен следующий способ постановки метода серийных разведений в бульоне.

Жидкая питательная среда, прошедшая предварительный контроль качества, готовится в соответствии с инструкцией изготовителя.

Рабочие растворы антибиотиков готовят в асептических условиях по схеме, аналогичной для метода серийных разведений в агаре, но в жидкой питательной среде и в концентрациях, вдвое превышающих заданные, затем разливают по 1,0 мл в пробирки.

Суспензию исследуемого микроорганизма готовят из бульонной или

взвеси агаровой культуры путем разведения в жидкой питательной

6

среде до концентрации 10 м.к./мл и вносят по 1,0 мл в пробирки с

растворами антибиотиков. Таким образом, конечная концентрация

5

микроорганизмов в инкубационной среде будет равна 5 х 10 м.к./мл.

Посевы инкубируют при 37 °С в течение 16 - 20 ч.

Учет результатов проводят визуально или спектрофотометрически. За МПК принимают минимальную концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста.

При постановке метода необходимо предусмотреть следующие контроли:

- чистоту суспензии микроорганизма, использованной для инокуляции, путем высева на неселективные среды;

- рост культуры в среде без антибиотика.

Качество постановки метода контролируется периодически с использованием референтных штаммов.
6.7.2. Диско-диффузионный метод

Постановка диско-диффузионного метода включает следующие этапы:

- приготовление питательных сред;

- приготовление суспензии микроорганизма и инокуляция;

- наложение дисков и инкубация;

- учет и интерпретация результатов.

Для получения достоверных результатов при постановке диско-диффузионного метода необходимо жестко соблюдать правила хранения и использования коммерческих дисков, в противном случае содержание в них антибиотиков может упасть ниже допустимого уровня (прежде всего в результате увлажнения) еще до истечения срока годности. Диски должны храниться при температуре 4 - 8 °С, плотно укупоренными, для дополнительной гарантии защиты от увлажнения во флаконах коммерческих дисков содержится силикагель. Флаконы с дисками следует извлекать из холодильника за 1 ч до начала работы и выдерживать закрытыми при комнатной температуре, что обеспечит выравнивание температуры дисков и окружающей среды и соответственно предотвратит образование конденсата влаги после открывания флаконов.
Приготовление чашек с питательной средой

К качеству питательных сред для постановки диско-диффузионного метода выдвигаются те же требования, что и к плотным питательным средам для постановки метода серийных разведений в агаре, соответственно используются и те же методы контроля качества.

Плотную питательную среду готовят в соответствии с инструкцией изготовителя. Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанавливают на строго горизонтальную поверхность (выверенную по уровню, без впадин и выпуклостей). Глубина агарового слоя в чашке должна быть 4,0 мм, что достигается внесением 25 - 30 мл расплавленного агара в чашку диаметром 100 мм. Размер и форма зоны ингибиции роста зависят от глубины и равномерности агарового слоя.

После заполнения чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Свежеприготовленные чашки перед инокуляцией культуры необходимо подсушить при 37 °С в течение 10 - 20 мин. с приоткрытой крышкой.

Чашки с агаром можно хранить в запаянных полиэтиленовых пакетах при 4 - 8 °С в течение 7 - 10 суток. Перед использованием их также необходимо подсушить в течение 10 - 20 мин. при 37 °С с приоткрытой крышкой.

Перед инокуляцией необходимо проконтролировать отсутствие конденсата жидкости на внутренней поверхности крышек.
1   ...   10   11   12   13   14   15   16   17   ...   25

Похожие:

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты...
Методические указания предназначены для специалистов органов, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор,...

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека iconПисьмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей...
В связи с поступающими обращениями по вопросу оформления удостоверений качества и безопасности пищевой продукции Федеральная служба...

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты...
Методические указания предназначены для специалистов органов, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор,...

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты...
Н. П. Ефремова); фгун "Центральный нии эпидемиологии" Роспотребнадзора (И. В. Михеева) с учетом предложений и замечаний фгун нии...

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты...
Методические указания предназначены для специалистов органов, уполномоченных осуществлять государственный санитарно-эпидемиологический...

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека iconФедеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека письмо
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека информирует, что показатели заболеваемости...

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека iconМетодические рекомендации гигиенические требования к организации...
Управление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Омской области

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека iconМетодические рекомендации и 103. 1-09
Разработаны Федеральным государственным учреждением здравоохранения "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Федеральной службы...

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека iconФедеральный арбитражный суд восточно-сибирского округа постановление...
Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Красноярскому краю Пучковского...

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека iconПрав потребителей и благополучия человека письмо
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в целях разъяснения порядка оформления Единой...

Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2013
контакты
vbibl.ru
Главная страница